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2017-2022年中国转染试剂行业市场规模现状及投资价值评估报告
观研网 http://www.proresearch.org ysyx 未知 发布时间:2017-09-01 10:04

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报告概况/目录
       外源基因转入真核细胞即通常所说的细胞转染技术,是研究基因表达调控及基因治疗的有效技术之一,目前可通过磷酸钙沉淀法、脂质体介导法、电穿孔法、显微注射法及病毒转染等实现,其中脂质体介导法具有安全、操作简便、对细胞毒性低、低免疫原性等特点,被广泛应用于细胞转染中。但脂质体转染也存在对细胞类型具有选择性,转染效率随细胞类型不同而差别较大的缺点,因此对于不同细胞需选择最适的脂质体进行转染,以获得较高的转染效率。

       大鼠心肌细胞系H9C2,有着骨骼肌的很多特性,是用于研究多种心血管药效的重要细胞系。H9C2也被用于研究与心脏衰竭有关基因的功能,如基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)-2和MMP-9。此外,还能以H9C2作为模型来研究多柔比星诱导的心肌细胞凋亡和细胞毒性。随着细胞转染技术的广泛应用,找到高效、无毒的转染H9C2细胞方法将为心血管疾病治疗提供更多思路。

       本研究分别用FuGeneHD、Lipofectamine2000、Lipofectamin3000和DNA-InCRISPR4种转染试剂转染带有增强绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因的质粒至H9C2细胞,以探究较适合H9C2细胞转染的方法。现报告如下。

       1材料与方法

       1.1材料

       1.1.1细胞系和质粒H9C2细胞、HEK293细胞、EGFP-LC3质粒均由本实验室保存。

       1.1.2主要试剂Dulbecco改良Eagle高糖培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;FuGENEHD转染试剂购自美国Roche公司;Lipofectamine2000转染试剂、Lipofectamine3000转染试剂购自美国Invitrogen公司;DNA-InCRISPR转染试剂购自英国Amsbio公司;质粒提取试剂盒购自美国Omega公司;CellCountingKit-8(CCK-8)细胞增殖试剂盒购自日本同仁化学公司。1.1.3主要仪器倒置荧光显微镜(OBSERVERD1/AX10camHRC,德国卡尔•蔡司公司),多功能荧光酶标仪(SynergyMx,美国伯腾仪器有限公司)。

       1.2方法

       1.2.1质粒制备将质粒EGFP-LC3转化大肠杆菌感受态DH5a,挑出阳性克隆,在含有氨苄抗性的LB培养基中扩大培养,用质粒提取试剂盒提取纯化后测定浓度和纯度,具体操作步骤根据产品说明书进行。

       1.2.2细胞转染将H9C2细胞和HEK293细胞分别按1×104个/孔接种于96孔板,待细胞生长至约70%汇合度时转染EGFP-LC3质粒,每孔转染0.1μg质粒。Lipofectamine3000和Lipofectamine2000转染试剂分别以转染试剂∶质粒=1.5μL∶1μg和3μL∶1μg的比例配制质粒-脂质体复合物;FuGENEHD和DNA-InCRISPR转染试剂则分别以2μL∶1μg、3μL∶1μg、4μL∶1μg的比例配制质粒-脂质体复合物,后续转染步骤严格按照每种转染试剂的说明书进行操作,37℃培养48h后检测转染效率。

       1.2.3荧光显微镜采图细胞转染48h后,用倒置荧光显微镜观察EGFP绿色荧光蛋白信号,使用ZEN图像处理系统进行图像采集与分析。

       1.2.4荧光强度检测细胞转染48h后,弃去培养基,用磷酸盐缓冲液洗1次后每孔加入100μL磷酸盐缓冲液,用多功能荧光酶标仪在488nm激发光,509nm发射光下检测转染细胞中绿色荧光强度。1.2.5细胞活性检测细胞转染48h后,换成新鲜培养基,每孔加入10μLCCK-8溶液,在细胞培养箱内继续孵育2h,然后用酶标仪在450nm处测定各孔的吸光度。

       1.3统计学方法

       所有统计均在GraphPadPrism6软件中完成。每组实验重复3次以上,所有数据均以均数±标准差的形式表示,组间荧光强度和细胞活性比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

       2结果

       2.1H9C2和HEK29细胞转染效率比较

       将FuGENEHD和EGFP-LC3质粒分别以2μL∶1μg、3μL∶1μg、4μL∶1μg的比例配制质粒-脂质体复合物,对H9C2细胞和HEK293细胞进行转染,48h后用荧光显微镜观察,发现对于两种细胞,FuGENEHD和质粒比例为4μL∶1μg时转染效率最高;但和HEK293细胞相比,H9C2细胞转染效率明显要低很多。

       2.2各种转染试剂转染H9C2细胞效率比较

       将4种转染试剂和质粒以不同比例配制质粒-脂质体复合物后转染H9C2细胞,48h后用荧光显微镜观察,结果表明Lipofectamine3000(3μL∶1μg)转染效率>50%,转染效率最高;而DNA-InCRISPR(4μL∶1μg)转染效率最低,<1%;Lipofectamine2000(3μL∶1μg)转染效率约为10%,略高于FuGENEHD(4μL∶1μg)。进一步用荧光酶标仪检测各转染孔的荧光强度,结果也是一致的。

       图:4种转染试剂转染H9C248h后EGFP荧光强度

资料来源:公开资料,观研天下整理

       2.3各种转染试剂对H9C2细胞活性的影响

       用CCK-8试剂检测4种转染试剂对H9C2细胞活性的影响,结果显示,FuGENEHD、DNA-InCRISPR和Lipofectamine3000对H9C2活性影响无明显差异,转染48h后细胞活性均在90%左右;而Lipofectamine2000对H9C2细胞毒性较前3种转染试剂都大,转染48h后细胞活性仅为59.60%。

       图:4种转染试剂转染H9C248h后细胞活性

资料来源:公开资料,观研天下整理

       3小结
       

       脂质体是目前实验研究中使用最广泛的非病毒转染载体,相对于其他非病毒载体,具有更高的转染效率,并且与病毒载体相比,具有低免疫原性和低致瘤性等优点,因此被广泛应用于基因转染等研究中。脂质体转染试剂主要有4种,包括免疫脂质体、带负电荷脂质体、阳离子脂质体和配体脂质体。其中阳离子脂质体是被研究最多的脂质体,是将基因、蛋白和其他分子转运进入细胞的重要载体。对于如何提高阳离子脂质体转染效率,国内外已经进行了大量研究。潘宁等采用Lipofectamine2000包裹重组质粒转染人克隆结肠腺癌细胞Caco-2细胞,通过优化细胞接种密度、DNA用量及脂质体与DNA比例、脂质体-DNA复合物形成时间、细胞与脂质体复合物的孵育时间、细胞传代次数等条件,获得了这些因素的最佳组合转染方案。

       虽然目前很多脂质体转染试剂在提高转染效率方面取得了进步,但是由于不同细胞的细胞表面结构以及细胞膜、核膜结构均存在较大差异,同种转染试剂在不同细胞的转染效率也会不尽相同。Liu等用聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)阳离子脂质体转染H9C2细胞,只获得了13.6%的转染效率,而同样用PEI转染CHO-K1细胞,转染效率却高达93.6%。可见脂质体对细胞具有选择性,不同细胞由于细胞表面结构不同、细胞倍增时间不同等,同种转染试剂对不同细胞的转染效率是不同的。本研究也比较了FuGeneHD转染试剂对H9C2和HEK293细胞的转染效率,对转染后细胞进行荧光采图,发现HEK293细胞转染效率要远远高于H9C2细胞。

       随着对阳离子脂质体的研究越来越多,更多新型的阳离子脂质体被研发出用于细胞转染。为了获得H9C2细胞较高的转染效率,我们分别比较了FuGeneHD、Lipofectamine2000、Lipofectamin3000和DNA-InCRISPR这4种阳离子脂质体对H9C2细胞的转染效率。Lipofectamine2000用于外源DNA的转染载体在很多文献中都有报道,是一种经典的阳离子脂质体转染试剂,但由于其操作时需要无血清转染环境,并且需在转染后3~5h更换细胞培养液,操作上较其他几种转染试剂要复杂。而Lipofecrtamin3000则是Lipofectamin2000的升级,可在含血清的培养环境中完成。FuGENEHD是一种以脂质体为基础的多成分转染试剂,在多种细胞中具有高效转染的效果,但在本研究中发现其对H9C2细胞转染效率并不理想。DNA-InCRISPR是由AMSBIO公司推出的适用于类似于CRISPR/Cas9等相对分子质量较大的质粒转染的脂质体载体。我们通过对转染试剂和质粒浓度的摸索,发现Lipofectamine3000转染效率高于Lipofectamine2000,后者又高于FuGENEHD,而DNA-InCRISPR转染效率最低。

       研究表明DNA浓度也是影响转染效率的重要因素,DNA浓度并非越高越好,过高浓度的DNA反而会抑制转染效率,这可能是过量DNA会沉积于细胞表面,对细胞造成一定毒性作用。而脂质体和DNA比例与脂质体-DNA复合物的粒径和形态有关,随着两者比例的增加,脂质体复合物的粒径和电荷比也会相应增加,从而影响转染效率。有研究显示,一定粒径大小的脂质体复合物有利于提高转染效率,一方面在进入细胞前粒径较大的脂质体可以延迟脂质体和DNA的解离;另一方面在进入细胞后较大粒径脂质体复合物形成的大囊泡更容易崩解,从而释放大量的DNA进入细胞质中。但粒径过大的脂质体复合物又会对细胞产生毒性。因此最佳比例的脂质体和DNA复合物对转染效率影响至关重要。本实验因此摸索了不同脂质体-DNA复合物比例,发现当Lipofectamine3000和质粒比例为3μL∶1μg时,转染效率最高。

       由于脂质体复合物对细胞会产生一定毒性,如脂质体复合物可能导致细胞发生一些改变,包括细胞收缩、有丝分裂减少等;也可能对蛋白激酶C等蛋白质带来有害影响。因此在获得较高转染效率的同时也要尽量减少对细胞的毒性。对4种转染试剂转染H9C2细胞24h后检测细胞活性,结果显示Lipofectamine2000对H9C2细胞毒性较另3种转染试剂都要大,这可能与Lipofectamine2000阳离子脂质体的特性有关,可能参与了细胞某些生理活动,如诱发细胞凋亡、抑制腺苷三磷酸酶活性等。

       因此综上考虑,本研究的4种转染试剂中Lipofectamine3000对H9C2细胞转染效率最高,而转染毒性相对较低,更适合用于H9C2细胞的转染。

       观研天下发布的《2017-2022年中国转染试剂行业市场规模现状及投资价值评估报告》内容严谨、数据翔实,更辅以大量直观的图表帮助本行业企业准确把握行业发展动向、市场前景、正确制定企业竞争战略和投资策略。本报告依据国家统计局、海关总署和国家信息中心等渠道发布的权威数据,以及我中心对本行业的实地调研,结合了行业所处的环境,从理论到实践、从宏观到微观等多个角度进行市场调研分析。它是业内企业、相关投资公司及政府部门准确把握行业发展趋势,洞悉行业竞争格局,规避经营和投资风险,制定正确竞争和投资战略决策的重要决策依据之一。本报告是全面了解行业以及对本行业进行投资不可或缺的重要工具。
       本研究报告数据主要采用国家统计数据,海关总署,问卷调查数据,商务部采集数据等数据库。其中宏观经济数据主要来自国家统计局,部分行业统计数据主要来自国家统计局及市场调研数据,企业数据主要来自于国统计局规模企业统计数据库及证券交易所等,价格数据主要来自于各类市场监测数据库。

第一章行业概述及世界与中国市场发展现状
1.1转染试剂行业简介
1.1.1转染试剂行业界定及分类
1.1.2转染试剂行业特征
1.2转染试剂产品主要分类
1.2.1不同种类转染试剂价格走势
1.2.2脂质类转染试剂
1.2.3高分子聚合物转染试剂
1.3转染试剂主要应用领域分析
1.3.1转染试剂主要应用领域
1.3.2应用于蛋白质生成
1.4世界与中国市场发展现状对比
1.4.1世界市场发展现状
1.4.2中国生产发展现状
1.5世界转染试剂供需现状
1.5.1世界转染试剂产能、产量、产能利用率
1.5.2世界转染试剂产量、表观消费量
1.5.3世界转染试剂产量、市场需求量
1.6中国转染试剂供需现状
1.6.1中国转染试剂产能、产量、产能利用率
1.6.2中国转染试剂产量、表观消费量
1.6.3中国转染试剂产量、市场需求量
1.7转染试剂中国及欧美日等相关行业政策分析

第二章世界与中国转染试剂产量、产值及竞争分析
2.1世界市场转染试剂产量、产值分析
2.1.1世界市场转染试剂产量分析
2.1.2世界市场转染试剂产值分析
2.1.3世界市场转染试剂产品价格分析
2.2中国市场转染试剂产量、产值分析
2.2.1中国市场转染试剂产量分析
2.2.2中国市场转染试剂产值分析
2.3转染试剂厂商产地分布
2.4转染试剂行业集中度、竞争程度分析
2.4.1转染试剂行业集中度分析
2.4.2转染试剂行业竞争程度分析
2.5转染试剂世界领先企业SWOT分析
2.6转染试剂中国企业SWOT分析

第三章从生产角度分析世界主要地区转染试剂产量、产值、市场份额
3.1世界主要地区转染试剂产量、产值市场份额
3.2中国市场转染试剂产量、产值分析
3.3美国市场转染试剂产量、产值分析
3.4欧洲市场转染试剂产量、产值分析
3.5日本市场转染试剂产量、产值分析
3.6东南亚市场转染试剂产量、产值分析
3.7印度市场转染试剂产量、产值分析

第四章从消费角度分析世界主要地区转染试剂消费量、市场份额
4.1世界主要地区转染试剂消费量市场份额
4.2中国市场转染试剂消费量分析
4.3美国市场转染试剂消费量分析
4.4欧洲市场转染试剂消费量分析
4.5日本市场转染试剂消费量分析
4.6东南亚市场转染试剂消费量分析
4.7印度市场转染试剂消费量分析

第五章世界与中国转染试剂主要生产商分析
5.1ThermoFisher
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析
5.2Promega
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析
5.3Roche
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析
5.4Qiagen
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析
5.5Polyplus-transfectionSA
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析
5.6Bio-RadLaboratories
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析
5.7LonzaGroup
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析
5.8Sigma
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析
5.9MirusBioLLC
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析
5.10MaxcyteInc.
(1)企业概况
(2)主营业务情况分析
(3)公司运营情况分析
(4)公司优劣势分析

第六章不同类型转染试剂产量、价格、产值市场分析
6.1世界市场不同类型转染试剂产量、产值市场分析
6.1.1世界市场转染试剂不同类型转染试剂产量市场分析
6.1.2世界市场不同类型转染试剂产值市场分析
6.1.32017-2022年世界市场不同类型转染试剂价格走势
6.2中国市场转染试剂主要分类产量、产值市场分析
6.2.1中国市场转染试剂主要分类产量市场分析
6.2.2中国市场转染试剂主要分类产值市场分析

第七章转染试剂上游原料及下游主要应用领域分析
7.1转染试剂产业链分析
7.2转染试剂产业上游供应分析
7.2.1上游原料供给状况
(1)高分子聚合物
(2)磷酸钙
7.2.2原料供应商及联系方式
(1)高分子聚合物
(2)磷酸钙
7.3世界市场转染试剂下游主要应用领域消费量、市场份额
7.4中国市场转染试剂主要应用领域消费量、市场份额

第八章中国市场转染试剂产量、消费量、进出口分析
8.1中国市场转染试剂产量分析
8.2中国市场转染试剂消费量分析
8.3中国市场转染试剂进口分析
8.4中国市场转染试剂出口分析
8.5中国市场进出口发展的因素分析

第九章中国市场转染试剂主要地区分布
9.1中国转染试剂生产地区分布
9.2中国转染试剂消费地区分布
9.3中国转染试剂市场集中度及发展趋势

第十章影响中国市场供需的主要因素分析
10.1转染试剂技术及相关行业技术发展
10.2进出口贸易现状及趋势
10.3下游行业需求变化因素
10.4市场大环境影响因素
10.4.1中国及欧美日等整体经济发展现状
10.4.2其他因素

第十一章未来行业、产品及技术发展趋势
11.1行业及市场环境发展趋势
11.2产品及技术发展趋势
11.3产品价格走势
11.4未来市场消费形态、消费者偏好

第十二章转染试剂相关行业销售渠道分析及建议
12.1国内相关行业市场转染试剂销售渠道
12.1.1当前的主要销售模式及销售渠道
12.1.2国内市场转染试剂未来销售模式及销售渠道的趋势
12.2企业海外转染试剂销售渠道
12.2.1海外转染试剂销售渠道
12.2.2产品外销优势
12.3转染试剂销售/营销策略建议
12.3.1中国转染试剂行业产品营销策略建议
12.3.2营销模式及销售渠道
(GYYX)
图表详见正文
特别说明:观研天下所发行报告书中的信息和数据部分会随时间变化补充更新,报告发行年份对报告质量不会有任何影响,请放心查阅。
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